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在實驗室不學菌種保藏方法,怎么混?

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1、傳代保存法:

有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時,會很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產菌種的保存。傳代保存時,培養基的濃度不宜過高,營養成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產酸菌種,則應在培養基中添加少量碳酸鈣?! ?span lang="EN-US">



一般地,大多數菌種的保藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養保存法雖然簡便,但其缺點也很明顯,如:①菌種管棉塞經常容易發霉;②菌株的遺傳性狀容易發生變異;③反復傳代時,菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉種,工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。

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2、液體石蠟覆蓋保存法:

該法較前一種方法保存菌種的時間更長,適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥,并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點,同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存,而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。

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3、載體保存法:

即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種,如:



① 土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是:取適量土壤(5),置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種,培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止,移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封,冷藏或室溫保存。



②砂土保存法:取清潔的砂,篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持23cm深,再經干熱滅菌后,加入1mL菌種培養液,經充分混勻后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌,再進行菌種保藏。



③硅膠保存法:以616目的無色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設法加以冷卻?!?span lang="EN-US">



④磁珠保存法:將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水

CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上1020粒磁珠,經干熱滅菌后,接入菌懸液,最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長達兩年半時間。



⑤麩皮保存法:在麩皮內加入60%的水,經滅菌后接種培養,最后干燥保藏。



⑥紙片(濾紙)保存法:將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內進行保存?!?span lang="EN-US">

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4、懸液保存法:

即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。

常用的有:

①蒸餾水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

②糖液保存法:適用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長達10年。除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存?! ?span lang="EN-US">

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5、寄主保存法:

即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

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6、冷凍保存法:

當采用這種保藏方法時,應注意以下幾點

①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞;

②要選擇適宜的培養基,因為某些微生物對冷凍的抵抗力,常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異;

③要選擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長;

④最好在菌液內不添加電解質(如食鹽等);

⑤可在菌液內添加甘油等保護劑,以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑,但對有些微生物而言,不加保護劑時更有效。

⑥原則上應盡快進行冷凍處理,但當加入保護劑時,可靜置一段時間后再進行處理。

⑦就動物細胞而言,應在-20℃范圍內以1/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對絕大多數微生物而言,則不必如此,如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍;

⑧若進行長期保存,則貯藏溫度越低越好;

⑨取用冷凍保存的菌種時,應采取速融措施,即在3540℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后,應盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降。

 

常用的冷凍保存法包括
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85)

低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多,有些可添加保護劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入低溫冰箱內進行保存的。

②干冰保存法(-70℃左右):即將菌種管插入干冰內,再置于冰箱內進行冷凍保存;

③液氮保存法(-196):是適用范圍最廣的微生物保存法。

 

其操作步驟如下:

a、裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.21mL的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

b、熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(-150-170)時,則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡230分鐘后,觀察有無色素進入安瓶。

d、緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮氣以約1/min的速度冷卻至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱內緩慢冷卻3060min。

e、速冷:最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃?!?span lang="EN-US">

 

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7、冷凍干燥保存法:

在進行冷凍干燥時,需注意以下幾個問題: 
a、冷凍干燥前的培養條件:首先檢驗菌種純度。一般地說,將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;
為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好,如細菌應達到1091010/mL。

b、菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽?! ?span lang="EN-US">

c、安瓶的準備:將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,自來水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,60℃恒溫干燥。

d、添加保護劑:常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法:在5mL菌種保藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,于-20℃冰箱中保存。

 

信息來源:https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU0Mzk3MDY5MQ==&mid=2247511290&idx=1&sn=e858545067beb66f3bb98db6c3fd1139&chksm=fb01a816cc76210000635e75ffd6d62ec3385d7b3f1b0583b805ccdbef58f1e7786e6d761c7f&mpshare=1&scene=1&srcid=1214gsJxicXUCVLBRNd2MuUf&sharer_sharetime=1607944843849&sharer_shareid=53c00c5aea8d273370e0b8e1fc31a74e&key=7e19afe4bc32aaec6d6e1a91e0fbc71a9a5083a2a2d1c9a47ad998c41f37569f13e101bc4a3af8cf1ffd400df4dc83f7c404a9be4c93810ffaca45a5f798a2cfe1876478adaaffa1d71aa01ce0bb0cee883949fa5e13fb6356cbc091c2afb33c0858665f3e44e4015cc76fb5296d6f2e2918a9bfaf6fa5ce9e3ccdddf072ad5a&ascene=1&uin=MTEzMjI3MTcwMw%3D%3D&devicetype=Windows+7&version=62080079&lang=zh_CN&exportkey=AQHqnFdhIXh9YDjXxc6EUXM%3D&pass_ticket=jPoc%2BLkMnT1ciHmY3LWvnYmDMsypG4hV9prHHn56Y9yieytglRg%2BFnCIfxK3VjRQ&wx_header=0

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